Фазовая микроскопия. Методы микроскопического исследования микроорганизмов. Что такое фазовый контраст

Метод, который позволяет резко повысить контрастность изображения объекта. Принцип метода состоит в выявлении сдвигов фазы световых колебаний, которые возникают, когда свет проходит сквозь структуру, имеющую показатель преломления, отличающийся от показателя преломления окружающей среды.

Фазовые сдвиги глазом непосредственно не улавливаются, но в специальном фазово-контрастном микроскопе структуры, имеющие более высокий показатель преломления (даже совершенно прозрачные), оказываются более темными (или более светлыми в зависимости от конструкции прибора), чем окружающий фон (рис. 1.28).

Рис. 1.28. Фото амебы (фазово-контрастная микроскопия)

Поляризационная микроскопия

Метод наблюдения в поляризованном свете для исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр.

Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете (рис. 1.29).

Рис. 1.29. Кристаллы урата натрия (Samaras N, Rossi C. N Engl J Med. 2012)

Ультрафиолетовая микроскопия

Метод основан на способности некоторых веществ избирательно поглощать ультрафиолетовые лучи с определенной длиной волны, принципиально почти ничем не отличается от обычной световой микроскопии и осуществляется при помощи микроскопов с кварцевой или отражательной (зеркальной) оптикой. Изображение рассматривается на флюоресцирующем экране визуально, а также фотографируется. Микроскопирование объектов позволяет выявить исследуемые вещества, не применяя окрашивания.

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия позволяет изучать как собственную (первичную) флюоресценцию ряда веществ, так и вторичную флюоресценцию, вызванную окрашиванием клеточных структур специальными красителями - флюорохромами. Принцип метода состоит в том, что некоторые вещества при световом облучении начинают светиться сами.

Для возбуждения флюоресценции в видимой части спектра обычно пользуются синим светом или ультрафиолетовыми лучами. Многие вещества, не флюоресцирующие в видимой области (в особенности нуклеиновые кислоты), при освещении ультрафиолетовыми лучами начинают флюоресцировать и могут выявляться без применения флюорохромов (рис. 1.30).

Рис. 1.30. Процесс митоза (флюоресцентная микроскопия)

Метод электронной микроскопии

Метод, при котором вместо света используют поток электронов, стеклянные линзы заменены электромагнитными полями, максимальное увеличение 1,5 млн. раз. Не требует окраски препарата. (1933 г. - Германия)

Применениеэлектронноймикроскопиивбиологии позволило изучить сверхтонкую структуру клетки внеклеточных компонентов тканей. На основании результатов, полученных с помощью данного метода (максимальное увеличение до 800 - 1200 тыс.), начиная с 40-х гг. было описано тонкое строение мембран, митохондрий, рибосом и других клеточных, а также внеклеточных структур, выявлены некоторые макромолекулы, например ДНК.

Растровая (сканирующая) электронная микроскопия дает возможность изучать тонкое строение поверхности клеток и тканевых структур не только фиксированных объектов, но и живых животных. Техника приготовления биологических препаратов для электронноймикроскопиивключает процедуры, сохраняющие ткань в условиях глубокого вакуума под пучком электронов и реализующие высокое разрешение. Для повышения контраста изображения клеток их обрабатывают «электронными красителями», сильно рассеивающими электроны.

Применение электронноймикроскопиив биологии существенно изменило и углубило прежние представления о тонком строении клетки(рис. 1.31-1.34).

Рис. 1.31. Снимок стафиллококков с помощью растрового электронного микроскопа

Рис. 1.32. Электронный микроскоп

Рис. 1.33. Устройство электронного микроскопа

Рис. 1.34. Снимок Helicobacter с помощью растрового электронного микроскопа

(Dr. Patricia Fields, Dr. Collette Fitzgerald)

Метод центрифугирования

Разделение смесей на составные части под действием центробежной силы. Применяется при разделении органоидов клетки, легких и тяжелых фракций органических веществ и т. д. при этом ускорение в 300 раз больше, чем земное притяжение.

Центрифуга служит для разделения сыпучих тел или жидкостей различного удельного веса и отделения жидкостей от твёрдых тел путем использования центробежной силы. При вращении в центрифуге частицы с наибольшим удельным весом располагаются на периферии, а частицы с меньшим удельным весом - ближе к оси вращения(рис. 1.35).

Рис. 1.35. Устройство центрифуги

/ Бадяева Е.Е. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. - Хабаровск, 2018 — №17 . — С. 34-37.

КГБУЗ «Бюро судебно-медицинской экспертизы» министерства здравоохранения Хабаровского края (нач. – к.м.н. А.В. Нестеров), г. Хабаровск

Использование методики фазово-контрастной микроскопии для установления кровоизлияний на гнилостно измененных тканях

библиографическое описание:
Использование методики фазово-контрастной микроскопии для установления кровоизлияний на гнилостно измененных тканях / Бадяева Е.Е. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. - Хабаровск, 2018. — №17. — С. 34-37.

html код:
/ Бадяева Е.Е. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. - Хабаровск, 2018. — №17. — С. 34-37.

код для вставки на форум:
Использование методики фазово-контрастной микроскопии для установления кровоизлияний на гнилостно измененных тканях / Бадяева Е.Е. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. - Хабаровск, 2018. — №17. — С. 34-37.

wiki:
/ Бадяева Е.Е. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. - Хабаровск, 2018. — №17. — С. 34-37.

Определение прижизненности и давности образования механических повреждений является одной из актуальных проблем судебной медицины. Если ткани трупа находятся в состоянии гнилостных изменений, диагностика прижизненности и давности образования кровоизлияний многократно усложняется. Это связано с изменениями, происходящими под воздействием протеолитических ферментов. При аутолизе отмечается набухание цитоплазмы клеток, увеличение ее абсолютных размеров, ядра клеток становятся светлее и уменьшаются в размерах. По мере дальнейшего набухания цитоплазмы границы клеток становятся нечеткими, цитоплазма приобретает зернистый вид. Процесс набухания клеток сменяется их сморщиванием и уменьшением их абсолютных размеров, при этом увеличивается интенсивность восприятия цитоплазмой кислых красителей.

В состоянии выраженных гнилостных изменений клетка утрачивает способность к окрашиванию.

Микроскопию препаратов с аутолитическими и гнилостными изменениями проводят под малым и большим увеличением для выявления характерных структур и определения принадлежности тканей и органов, представленных на исследование.

В коже аутолитические изменения, прежде всего, возникают в железистых образованиях кожи (сальных и потовых железах), затем в эпидермисе. Волокнистые структуры более устойчивы к аутолизу. В эпидермисе отмечается нечеткость границ между клетками, базофилия цитоплазмы, бледная окраска ядер.

В скелетной мускулатуре по мере разрешения трупного окоченения выявляются аутолитические изменения в виде помутнения, зернистости и гомогенизация миоплазмы. Ядра в данном случае подвергаются лизису.

В сосудах отмечается разрыхление и набухание интимы. Ядра пикнотичные либо лизированные. В эритроцитах выщелачивается гемоглобин и они слабо окрашиваются эозином, контуры их некоторое время сохраняются, затем представляют собой сетчатые структуры, а при выходе гликогена контуры эритроцитов не различаются.

Судебно-медицинское значение гистологического исследования гнилостно изменённых тканей ограничивается не только определением органной и тканевой принадлежности, но и возможностью определения прижизненности кровоизлияний. Для выявления кровоизлияний в гнилостных тканях используется методика окраски по Лепене. Данная методика основана на выявлении пероксидазной активности гемоглобина в тканях путем окрашивания срезов раствором бензидина и перекиси водорода, эритроциты и гемоглобин при данной окраске должны окраситься в темно-коричневый цвет. На практике гемоглобиновый пигмент красится в желто-коричневый, буро-коричневый, желто-зеленый цвета. Цитоплазма красится в бледно-серо-голубой и бледнобежевой цвет. При резко выраженных гнилостных изменениях тканей, обильной гнилостной бактериальной и грибковой микрофлоре может быть получена ложноотрицательная реакция по Лепене (отрицательная окраска при имеющем место кровоизлиянии). Таким образом, в настоящее время нет совершенных методик, позволяющих выявлять кровоизлияния в тканях, подверженных гнилостным изменениям.

Нами получен положительный опыт применения фазово-контрастной микроскопии при исследовании кровоизлияний на гнилостно измененных тканях. Применение данного метода позволяет выявить не только наличие в тканях кровоизлияний, но и степень их выраженности. Метод фазового контраста основан на том, что фазовая скорость света обратно пропорциональна показателю преломления. Фаза луча, проходящего через объект с более высоким показателем преломления, чем у окружающей среды, будет запаздывать по сравнению с фазой того луча, который проходит только через среду. Глаз не способен воспринимать фазовые изменения света. Поэтому прозрачные, неконтрастные объекты при обычном микроскопическом исследовании остаются невидимыми. В фазово-контрастном микроскопе специальный конденсор и особо устроенный объектив регулируют изменения фазы световых волн и превращают разность фаз в разность интенсивностей света, благодаря чему детали строения объекта становятся доступными для глаза. Система колец в конденсоре и объективе отделяет те лучи, которые диафрагмировали (отклонились) на объекте, от тех, которые не диафрагмировали. После того как диафрагмировавшие лучи проходят через фазовую пластинку объектива, вносящую дополнительный сдвиг по фазе, они рекомбинируются с недиафрагмировавшими лучами. Именно таким образом удается резко повысить контраст клеток или внутриклеточных структур. При гнилостных изменениях тканей фазово-контрастная микроскопия позволяет облегчить определение принадлежности тканей, их структуру.

Рис.1. Очаг геморрагического пропитывания в межуточной строме. Окраска гематоксилин-эозином (слева).

Рис.1. Очаг геморрагического пропитывания в межуточной строме. Окраска по Лепене (справа)

Рис. 2. Очаг геморрагического пропитывания в межуточной строме.
Фазово-контрастная микроскопия

В ноябре 2018 года в лабораторию поступил материал из трупа, который находился в земле с 2017 года. Его органы и ткани находились в состоянии выраженных гнилостных изменений. При стандартной окраске тканей и органов в одном из микропрепаратов обнаружены очаги буроватого прокрашивания, напоминающие кровоизлияния. Волокнистые структуры были окрашены в грязно-розовато-сиреневый цвет, клеточно-ядерное строение не определялось, в окружности расширенных и полнокровных сосудов среднего калибра были отмечены мелкие очажки геморрагического пропитывания в межуточной строме, вне связи с сосудами. Реакция по Лепене была представлена в виде очаговых бледно-коричневых мелкозернистых масс, слабо различимых на общем светложелтом фоне (рис. 1). При фазово-контрастной микроскопии кровоизлияния были представлены зернистыми массами, которые хорошо контурировались по отношению к окружающим тканям (рис. 2).

Данный пример наглядно показывает, что фазово-контрастное исследование в гнилостно измененных и поврежденных тканях помогает:

определить расположение кровоизлияний в ткани;

определить объем инфильтрации тканей эритроцитами (прижизненность).

Применение данного метода также позволяет экономить на окрасках микропрепаратов, заменяя их использование фазово-контрастным методом, что в условиях недостаточного финансирования гистологических отделений позволяет расставить приоритеты при плановых закупках материалов и реагентов.

При микроскопии неокрашенных микроорганизмов, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменения интенсивности света (амплитуды) не происходит, а изменяется только фаза прошедших световых волн. Поэтому глаз этих изменений заметить не может и наблюдаемые объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными. Для наблюдения таких объектов используют фазово-контрастную микроскопию , основанную на превращении невидимых фазовых изменений, вносимых объектом, в амплитудные, различимые глазом.
Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:
1) набора объективов со специальными фазовым пластинками;
2) конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов;
3) вспомогательного микроскопа.

Настройка фазового контраста основном заключается в следующем: 1) заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазовые (обозначенные буквой Ф или ph) ; 2) устанавливают объектив малого увеличения. Отверстие в диске конденсора должно быть без кольцевой диафрагмы (обозначенной цифрой «0»); 3) настраивают свет по Келеру; 4) выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат; 5) поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму; 6) вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный микроскоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный микроскоп и вновь устанавливают окуляр.

Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст). В РФ выпускают устройство КФ-4 для позитивного фазового контраста.
Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики - так называемые инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор - сверху. За изобретение фазово-контрастной микроскопии его автор голландский физик Цернике был удостоен Нобелевской премии.

ФАЗОВО-КОНТРАСТНАЯ МИКРОСКОПИЯ - способ микроскопического исследования прозрачных, не поглощающих света объектов, основанный на усилении контраста изображения.

Прозрачные, не окрашенные объекты (живые и фиксированные микроорганизмы, клетки и др.), отличающиеся от окружающей среды по показателю преломления, не поглощают света, но изменяют его скорость и, следовательно, фазу световых колебаний. Причем степень этих изменений зависит от величины показателя преломления и толщины структур объекта. Однако эти изменения не воспринимаются глазом, не регистрируются фотоматериалами, и исследуемые объекты при световой микроскопии почти не отличаются от фона. Для усиления контрастности изображения применяют фазово-контрастная микроскопия. Ее широко используют для прижизненного изучения микроорганизмов, простейших, клеток растений и животных. В гематологии, например, фазово-контрастную микроскопию применяют для подсчета и дифференциации клеток, изучения их подвижности, дифференциальной диагностики лейкозов и др.

Способ превращения фазовых изменений в соответствующие им амплитудные был предложен в 30-х годов 20 века голландским физиком Зернике (F. Zernike). Принцип фазово-контрастной микроскопии заключается в том, что свет, не отклоненный объектом, проходит через нанесенное на одну из линз объектива фазовое кольцо, смещающее его фазу на четверть длины волны и ослабляющее его интенсивность (для того, чтобы уравнять ее с интенсивностью дифрагированного объектом света), а дифрагированный (отклоненный) свет проходит мимо фазового кольца (см. Микроскоп).

Прохождение прямого, не дифрагированного объектом света через фазовое кольцо обеспечивается находящейся в конденсоре кольцевой диафрагмой, проекция к-рой в плоскости выходного зрачка объектива равна по диаметру и ширине фазовому кольцу и должна полностью совпадать с ним. Для каждого объектива имеется своя кольцевая диафрагма.

В плоскости изображения происходит интерференция световых волн, прошедших и не прошедших через фазовое кольцо. При этом возникают различия в амплитуде, отражающие изменения фазы в зависимости от свойств участков объекта. В отличие от фазовых амплитудные изменения световых волн хорошо видны глазом и могут быть зарегистрированы.

В зависимости от способа изготовления фазового кольца фаза прямого, не дифрагированного объектом света может либо опережать фазу дифрагированного, либо отставать от нее. При этом возникает или наиболее распространенный позитивный фазовый контраст, где частицы с показателем преломления большим, чем у окружающей среды (более плотные), выглядят темными на светлом фоне, или негативный, где такие же частицы дают изображение светлее окружающего фона. Необходимо, однако, отметить, что эта картина сохраняется только до определенной величины показателя преломления, а после достижения этой величины происходит инверсия контраста, то есть наблюдаются обратные закономерности.

Фазово-контрастное устройство (в частности, КФ-4, выпускаемое в нашей стране) состоит из объективов, на одну из линз которых нанесено фазовое кольцо, конденсора с револьверным диском, содержащим набор кольцевых диафрагм, и центрировочным приспособлением, а также вспомогательного микроскопа (рис. 1), с помощью которого в плоскости выходного зрачка объектива можно наблюдать за совмещением фазового кольца и проекции кольцевой диафрагмы конденсора. Это устройство может быть установлено на любой микроскоп.

Существует ряд конструктивных разновидностей фазово-контрастных устройств: с одной кольцевой диафрагмой для всех объективов при использовании панкратического конденсора (например, в отечественных микроскопах МБИ-6, МБИ-15), с так называемым вынесенным зрачком, при котором фазовое кольцо помещается вне объектива, что позволяет использовать для фазово-контрастной микроскопии обычные объективы (такое устройство имеется в отечественных микроскопах МБИ-13, МБИ-17). Выпускаются также устройства с переменным фазовым контрастом (с двумя кольцами разного диаметра).

Одной из разновидностей негативного фазового контраста является аноптральное (фазово-темнопольное) устройство. Аноптральное устройство было создано в 1953 году Вильской (A. Wilska) и используется для изучения объектов, вносящих небольшой сдвиг фазы. Модификация этого метода была предложена М. А. Пешковым и широко использовалась у нас в стране.

Методика приготовления препаратов для фазово-контрастной микроскопии зависит от объекта исследования и длительности его изучения: неокрашенные микроорганизмы можно рассматривать в препаратах раздавленная капля (см.), для длительного наблюдения и кинорегистрации размножения микроорганизмов используют специальные агаровые.микрокамеры (см.) на предметных стеклах (камера Фонбрюна, HI-образная камера Пешкова). Для изучения динамики процессов в однослойных культурах ткани также применяют микрокамеры (стационарные и перфузионные). Очень важными факторами, в значительной мере определяющими качество изображения, являются толщина препарата и различия в показателях преломления объекта и среды.

Техника фазово-контрастной микроскопии сравнительно проста: объективы и конденсор микроскопа заменяют на специальные (на отечественных фазово-контрастных объективах имеется обозначение Ф, на зарубежных - Ph), диск конденсора устанавливают в положение О (то есть сквозное отверстие без кольцевой диафрагмы), на предметный столик помещают препарат, настраивают свет по Келеру (см. Микроскопические методы исследования), вращением диска вводят кольцевую диафрагму, соответствующую увеличению объектива. Вместо окуляра устанавливают вспомогательный микроскоп. Выдвигая его верхнюю часть, получают резкое изображение фазового кольца и кольцевой диафрагмы. Центрировочными винтами конденсора точно совмещают оба кольца, после чего вместо вспомогательного микроскопа устанавливают окуляр. При смене препарата целесообразно проверить совмещение колец (рис. 2).

Достоинством фазово-контрастной микроскопии является возможность проводить прижизненные наблюдения (без какой-либо обработки) биол. объектов, напр, макрофагов (рис. 3), а недостатком - возникновение светлого (в случае позитивного контраста) или темного (в случае негативного) ореола вокруг объекта и его структур. Более полная информация может быть получена при сочетании фазово-контрастной и люминесцентной микроскопии при применении как иммунолю-минесцентного (см. Иммунофлюоресценция), так и люминесцентно-цитохимического метода (см. Люминесцентная микроскопия). При работе с люминесцирующими сыворотками фазово-контрастной микроскопии позволяет убедиться в наличии микрообъекта в том случае, если он не связывает люминесцирующие антитела, а также изучать объекты, у которых антитела фиксируются на отдельных структурах.

Особенно большую роль в прижизненном цитологическом изучении динамики различных физиологических и патологических процессов в клеточной биологии, микробиологии, вирусологии сыграло сочетание фазово-контрастной и аноптральной микроскопии с микрокиносъемкой (см.). Этот метод был использован для изучения цитологии бактерий и простейших, митоза в различных клетках, цитопатического действия вирусов и риккетсий на клетки. Были также изучены особенности образования и развития L-форм бактерий и микоплазм, действие антибиотиков на бактерии.

Библиогр.: Кравченко А. Т., Милютин В. Н. и Гудима О. С. Микрокиносъемка в биологии, М., 1963; Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, под ред. К. И. Матвеева, с. 5, 25, М., 1973; Скворцов Г. Е. и др. Микроскопы, Л., 1969; Франсон М. Фазовоконтрастный и интерференционный микроскопы, пер. с франц., М., 1960; Cinemic-rography in cell biology, ed. by G. G. Rose, N. Y.-L., 1963; Zernike F. Diff-raktion theory of the knife edge test and its improved form of the phase contrast method, Physica, v. 1, p. 689, 1934.

М. Я. Корн, E. С. Станиславский.

Световые волны характеризуются длиной волны, амплитудой и фазой. Глаз человека способен различать длину волны (цвет) и амплитуду (интенсивность, яркость света), но не может обнаружить различия в фазе.

При микроскопии окрашенных объектов наблюдается изменение амплитуды (уменьшение яркости света) и избирательное поглощение света определенной длины волны (изменение цвета).

При наблюдении неокрашенных микроорганизмов, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменения интенсивности не происходит, а изменяется только фаза прошедших световых волн. Поэтому глаз изменений заметить не может и эти объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными.

Для наблюдения таких объектов используют фазово-контрастную микроскопию, основанную на превращении фазовых изменений, вносимых объектом, в амплитудные, различимые глазом.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом биологическом микроскопе и состоит из: 1) набора объективов со специальными фазовыми пластинками; 2) конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов; 3) вспомогательного микроскопа.

Настройка фазового контраста в основном заключается в следующем:

1) заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазово-контрастные;

2) устанавливают объектив малого увеличения и отверстие в диске конденсора без кольцевой диафрагмы (обозначенное цифрой "0");

3) настраивают свет по Кёлеру;

4) выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат;

5) поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму;

6) вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный микроскоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре точно совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный микроскоп и вновь устанавливают окуляр.

Фазово-контрастная микроскопия широко применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики - так называемые инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор - сверху. Иногда они заключены в термостат для наблюдения за динамикой изменений в клетках культуры ткани и снабжены кинокамерой.

Морфология некоторых микроорганизмов не может быть изучена с помощью описанных выше способов микроскопии. К ним относятся различные спирохеты и, в частности, лептоспиры, некоторые крупные вирусы. Для наблюдения этих микроорганизмов применяют темнопольную микроскопию.

Темнопольная микроскопия

Темнопольная микроскопия основана на способности микроорганизмов сильно рассеивать свет. Для темнопольной микроскопии пользуются обычными объективами и специальными темнопольными конденсорами. Существует несколько типов таких конденсоров, различающихся по устройству.

Основная особенность темнопольных конденсоров заключается в том, что центральная часть у них затемнена и прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают. Объект освещается косыми боковыми лучами и в объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, находящимися в препарате. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света.

Чтобы в объектив не попадали прямые лучи от осветителя, апертура его должна быть меньше, чем апертура конденсора. Для уменьшения апертуры в обычный объектив помещают диафрагму или пользуются специальными объективами, снабженными ирисовой диафрагмой.

При темнопольной микроскопии микроорганизмы выглядят ярко светящимися на черном фоне. При этом способе микроскопии могут быть обнаружены мельчайшие микроорганизмы, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности микроскопа. Однако темнопольная микроскопия позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает возможности изучить внутреннюю структуру.

Обычно с помощью темнопольной микроскопии изучают препараты типа "раздавленная капля". При этом очень строгие требования предъявляются к качеству предметных и покровных стекол и приготовлению препарата. Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные - 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует обращать особое внимание на отсутствие пузырьков и крупных частиц (все эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат).

Для темнопольной микроскопии необходимы яркие источники света, поэтому следует применять более мощные осветители и максимальный накал лампы.

Настройка темнопольного освещения в основном заключается в следующем:

1) устанавливают свет по Кёлеру; 2) заменяют светлопольный конденсор темнопольным; 3) на верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло или в крайнем случае дистиллированную воду; 4) поднимают конденсор до соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла; 5) объектив малого увеличения фокусируют на препарат; 6) с помощью центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно (иногда имеющее затемненный центральный участок); 7) поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения затемненного центрального участка и получения равномерно освещенного светлого пятна. Если этого сделать не удается, то надо проверить толщину предметного стекла (обычно такое явление наблюдается при использовании слишком толстых предметных стекол - конус света фокусируется в толще стекла).

После правильной настройки света устанавливают объектив нужного увеличения и исследуют препарат.

Похожая информация.