Во многих пищевых производствах имеет место гидролиз пищевых гликозидов, олигосахаридов и полисахаридов. Гидролиз зависит от многих факторов: рН, температуры, аномерной конфигурации, комплекса ферментов. Он важен не только для процессов получения пищевых продуктов, но также и для процессов их хранения. В последнем случае реакции гидролиза могут приводить к нежелательным изменениям цвета или, в случае полисахаридов, могут приводить к неспособности их образовывать гели.

Большое внимание сейчас уделяется получению различных зерновых сахарных сиропов из дешевого крахмалсодержащего сырья и крахмала (рожь, кукуруза, сорго и др.). Их получение сводится к использованию разных комбинаций амилолитических ферментных препаратов (б-амилазы, глюкоамилазы, в-амилазы). Возможности ферментативного способа получения разных сахаристых продуктов видны на диаграммах (см. рис. 1.1). Получение глюкозы (с помощью глюкоамилазы), а затем действие глюкозоизомеразы дает возможность получения глюкозофруктозных и высокофруктозных сиропов, применение которых позволяет заменять во многих производствах сахарозу. В табл. 1.1. представлены данные по "сладости" различных сиропов.

Известно, что б-D-(1,4)-связи в крахмале легче гидролизуются, чем в-D-(1,4)-связи в целлюлозе. Кроме того, медленная реакция гидролиза целлюлозы связана с ее строением.

Рис. 1.1. Возможность получения различных сахарных сиропов из кукурузного крахмала (кислотный, кислотно-ферментативный и ферментативный способы) : а-б - кислотный гидролиз; в-г - действие грибной амилазы на кислотный гидролизат (ГЭ = 50); д-е - действие в-амилазы на кислотный гидролизат (ГЭ = 20); ж-з - действие в-амилазы на разжиженный а-амилазой (ГЭ =20) субстрат; и-к - дальнейшее действие грибной амилазы или в смеси с в-амилазой и глюкоамилазой

При получении сахарных сиропов из крахмала степень конверсии крахмала в D-глюкозу измеряют в единицах глюкозного эквивалента (ГЭ) - это содержание (в %) образующихся редуцирующих сахаров, выраженное в глюкозе на сухие вещества (СВ) сиропа.

Таблица 1.1. Состав и сладость типичных высокофруктозных сиропов

Гидролиз крахмала

1. При гидролизе крахмала под действием кислот сначала имеет место ослабление и разрыв ассоциативных связей между макромолекулами амилозы и амилопектина. Это сопровождается нарушением структуры крахмальных зерен и образованием гомогенной массы. Далее идет разрыв б-D-(l,4)- и б-D-(1,6)-связей с присоединением по месту разрыва молекулы воды. В процессе гидролиза нарастает число свободных альдегидных групп, уменьшается степень полимеризации. По мере гидролиза и нарастания редуцирующих (восстанавливающих) веществ содержание декстринов уменьшается, глюкозы - увеличивается, концентрация мальтозы, три- и тетрасахаров сначала увеличивается, затем их количество снижается (см. рис. 1.2). Конечным продуктом гидролиза является глюкоза. На промежуточных стадиях образуются декстрины, три- и тетрасахара, мальтоза. Определенному значению глюкозного эквивалента соответствует определенное соотношение этих продуктов, и, варьируя длительностью гидролиза и условиями его проведения, можно получать различные соотношения отдельных продуктов гидролиза при той или иной величине глюкозного эквивалента.

Рис. 1.2.

Кислотный гидролиз долгое время был главным при получении глюкозы из крахмала. Этот способ имеет ряд существенных недостатков, которые связаны с использованием высоких концентраций кислот и высокой температуры, что приводит к образованию продуктов термической деградации и дегидратации углеводов и реакции трансгликозилирования.

2. Крахмал гидролизуется также и под действием амилолитических ферментов. К группе амилолитических ферментов относятся б- и в-амилаза, глюкоамилаза, пуллуланаза и некоторые другие ферменты. Амилазы бывают двух типов: эндо- и экзоамилазы. Четко выраженной эндоамилазой является б-амилаза, способная к разрыву внутримолекулярных связей в высокополимерных цепях субстрата. Глюкоамилаза и в-амилаза являются экзоамилазами, т. е. ферментами, атакующими субстрат с нередуцирующего конца.

б-Амилаза, действуя на целое крахмальное зерно, атакует его, разрыхляя поверхность и образуя каналы и бороздки, то есть как бы раскалывает зерно на части (см. рис. 1.3). Клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с образованием не окрашиваемых иодом продуктов - в основном низкомолекулярных декстринов. Процесс гидролиза крахмала многостадийный. В результате воздействия б-амилазы на первых стадиях процесса в гидролизате накапливаются декстрины, затем появляются неокрашиваемые иодом тетра- и тримальтоза, которые очень медленно гидролизуются б-амилазой до ди- и моносахаридов.

Рис. 1.3.

Схему гидролиза крахмала (гликогена) а-амилазой можно представить так:

в-Амилаза (б-1,4-глюканмальтогидролаза) является экзоамилазой, проявляющей сродство к предпоследней б-(1,4)-связи с нередуцирующего конца линейного участка амилозы или амилопектина (см. рис. 1.4). В отличие от б-амилазы, в-амилаза практически не гидролизует нативный крахмал; клейстеризованный крахмал гидролизуется до мальтозы в в-конфигурации. Схему можно записать следующим образом:

пища гидролиз крахмал полисахарид

Рис. 1.4.

Глюкоамилаза б-(1,4)-глюканглюкогидролаза является экзоферментом, катализирующим последовательно отщепление концевых остатков б-D-глюкозы с нередуцирующего конца крахмальной цепи. Многие глюкоамилазы обладают способностью так же быстро, как и б-1,4-связь, гидролизовать б-1,6-глюкозидные связи. Но это происходит только в том случае, когда за б-1,6-связью следует б-1,4-связь, поэтому декстран ими не гидролизуется. Отличительной особенностью глюкоамилаз является способность в десятки раз быстрее гидролизовать высокополимеризованный субстрат, чем олиго- и дисахариды.

Рис. 1.5.

Схематически механизм действия глюкоамилазы на крахмал представлен на рис. 1.5.

Ферментативный гидролиз крахмала присутствует во многих пищевых технологиях как один из необходимых процессов, обеспечивающих качество конечного продукта - в хлебопечении (процесс тестоприготовления и выпечки хлеба), производстве пива (получение пивного сусла, сушка солода), кваса (получение квасных хлебцев), спирта (подготовка сырья для брожения), различных сахаристых крахмалопродуктов (глюкозы, патоки, сахарных сиропов). На рис. 1.6 представлен состав различных сахарных сиропов, полученных кислотно-ферментативным способом - предварительная обработка кислотой, а затем действием ферментов б-, в- и (или) глюкоамилазы. Использование такого комбинированного способа гидролиза крахмала открывает широкие возможности для получения сиропов заданного состава.

Ферменты животного происхождения (пепсин, трипсин и др.) преимущественно получают из органов, в которых протекают интенсивные биохимические процессы (из слизистой желудка, печени, почек, селезенки и т. д.).

Источником растительных ферментов может быть пророщенное зерно (солод) различных злаков. В тропических и субтропических странах для промышленного производства ферментов в качестве сырья используют латекс дынного дерева (получают фермент папаин), ананас (бромелин), инжир (фицин), хрен (пероксидазу).

Ферменты различного происхождения используют либо непосредственно как технические ферментные препараты, либо служат исходным материалом для получения очищенных препаратов.

В связи с все возрастающими потребностями промышленности в ферментных препаратах растительные и животные источники их получения не устраивают производителей по ряду причин.

Органы животных можно получить только на мясокомбинатах, при этом возникает проблема их консервирования и хранения. Требуются большие временные и материальные затраты на выращивание самих животных.

Многие вышеназванные недостатки устраняются использованием для получения ферментов микроорганизмов (бактерий, плесневых грибов, дрожжей). Преимущества данного источника: микроорганизмы быстро растут на дешевых питательных средах; содержание фермента в расчете на единицу белка биомассы значительно больше; путем генетических изменений можно увеличить выход нужного фермента; выделить ферменты с улучшенными свойствами __ устойчивые к температуре, кислотам, щелочам. Микробные ферменты аналогичны ферментам растений и животных, но есть виды, которые не встречаются ни в растениях, ни у животных.

В бродильных производствах используют ферменты растительного (в виде солода) и микробного происхождения.

Контрольные вопросы

1 Дайте определение фермента.

2 Приведите основные характерные особенностеи ферментов как катализаторов.

3 Приведите классификацию ферментов.

4 Объясните, что такое субстрат, активатор, ингибитор, активный центр, ферон, простетическая группа.

5 Охарактеризуйте влияние температуры, рН, концентрации фермента и субстрата, присутствие активаторов и ингибиторов на скорость ферментативной реакции.

6 Перечислите источники ферментов. Дайте им характеристику.

2.7 ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ

1 Гидролиз крахмала.

2 Гидролиз белков.

3 Гидролиз некрахмальных полисахаридов.

4 Ферментные препараты: характеристика и номенклатура.

5 Иммобилизованные ферменты

1 Гидролиз крахмала

Большинство промышленно важных ферментов относятся к классу гидролаз, потребность в которых исчисляется десятками тысяч тонн. В технологии бродильных производств гидролазам принадлежит огромная роль, так как именно они отвечают за подготовку сырья к сбраживанию.

К гидролазам относятся амилолитические, протеолитические, цитолитические, липолитические, пектолитические и другие ферменты.

Гидролиз крахмала осуществляется амилолитическими ферментами.

Крахмал - полисахарид, состоящий в свою очередь из двух полисахаридов, которые отличаются степенью полимеризации и типом строения – амилозой (примерное содержание 20-30 %) и амилопектином (%). Структурной единицей крахмала, а, следовательно, амилозы и амилопектина, является глюкоза, остатки которой соединены между собой α-1,4 и α-1,6- глюкозидньми связями.

Амилоза имеет линейное строение, связь между остатками глюкозы α-1,4 (между 1-м и 4-м углеродными атомами). Растворима в горячей воде без набухания. Образует растворы невысокой вязкости. Молекулярная масса от 60 до 600. С йодом дает синее окрашивание.

о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-

Рисунок 16 – Строение амилозы

Амилопектин представляет собой разветвленную цепь, состоящую из большого числа глюкозных остатков (около 2500). Главная цепочка состоит из 25-30 остатков, а боковые __ из 15-18. В амилопектине остатки глюкозы на линейных участках связаны α-1,4- связью, а в местах ветвления связь α-1,6. В воде не растворяется. При нагревании образует клейстер. С йодом дает фиолетовое окрашивание.

Гидролиз крахмала и продуктов его частичного гидролиза, а также гликогена, осуществляется амилазами (α-амилазой, β-амилазой, глюкоамилазой и другими амилолитическими ферментами).

α- амилаза (декстриногенамилаза) - по механизму действия относится к эндоферментам, т. е. действует на молекулу субстрата изнутри, беспорядочно, что приводит к быстрому снижению вязкости раствора крахмала. Гидролизует связи α-1,4 в полисахаридах, содержащих три и более остатков Д-глюкозы.

Амилоза под действием α-амилазы сначала распадается на декстрины среднего размера, которые затем расщепляются на низкомолекулярные декстрины и мальтозу. При длительном действии фермента амилоза практически полностью превращается в мальтозу и небольшое количество глюкозы.

Действие α-амилазы на амилопектин приводит к образованию мальтозы и низкомолекулярных декстринов.

Общая схема гидролиза крахмала α-амилазой:

α-амилаза

Крахмал низкомолекулярные декстрины

(много)+ мальтоза (мало) + глюкоза (очень мало)

Оптимальные условия действия фермента: рН 5,7, температура 70 °С.

β-амилаза (сахарогенамилаза) __ экзофермент, катализирует гидролиз связей α -1,4 в полисахаридах, последовательно отщепляя остатки мальтозы от нередуцирующего (где отсутствует свободная альдегидная группа) конца цепей. β-амилаза расщепляет амилозу полностью (если количество молекул глюкозы в ней четное) в мальтозу, если нечетное, то наряду с мальтозой образуется мальтотриоза.

В амилопектине β-амилаза действует лишь на свободные нередуцирующие концы глюкозных цепочек с образованием мальтозы и высокомолекулярных декстринов. Действие ее прекращается при приближении к разветвлению (где имеется связь α-1,6) на расстоянии одной молекулы глюкозы. Образовавшиеся декстрины гидролизуются дальше α-амилазой до декстринов меньшей молекулярной массы.

Общая схема гидролиза крахмала под действием β-амилазы:

β-амилаза

Крахмал высокомолекулярные декстрины (много) + мальтоза (много) + мальтотриоза (мало)

Оптимальные условия действия β-амилазы: рН 4,7, температура 63 °С.

Таким образом, при совместном действии α- и β-амилаз на крахмал только 80 % его превращается в сбраживаемые сахара (мальтозу, глюкозу, мальтотриозу) и 20 % __ в декстрины с 5-8 глюкозными остатками.

Предельная декстриназа __ эндофермент, неупорядоченно гидролизует в крахмале, гликогене, декстринах α-1,6-глюкозидную связь. Чаще всего образуется мальтотриоза. Оптимальные параметры действия: рН 6,5, температура 50оС.

Глюкоамилаза __ экзофермент, гидролизует связи α-1,4 и α-1,6 в полисахаридах, последовательно отщепляя по одному остатку глюкозы с нередуцирующих концов цепей. Связи α-1,4 в крахмале разрушаются быстрее, чем α-1,6. Оптимальные условия: рН 4,5-4,6, температура 55-60°С.

В различных бродильных производствах к гидролизу крахмала предъявляют разные требования. В производстве спирта необходимо прогидролизовать крахмал как можно глубже, чтобы получить больше сбраживаемых сахаров, а, следовательно, более высокий выход спирта.

В производстве пива полный гидролиз крахмала не осуществляют, так как в среде кроме сбраживаемых сахаров (нужных для образования определенного количества спирта) должны находиться низкомолекулярные декстрины, придающие полноту вкуса и вязкость пиву.

В зависимости от источника фермента свойства амилаз и других ферментов могут сильно отличаться не только по механизму действия и конечным продуктам реакции, но и оптимальным условиям для проявления максимальной активности. Выше были приведены оптимальные параметры действия для α- и β-амилаз солода.

Бактериальные амилазы отличаются от солодовых большей термостабильностью. Оптимальные параметры действия: температура 80-85 оС (иногда до 90-95 оС), рН 5,5-5,8.

Грибные амилазы (к ним, в частности, относится глюкоамилаза) более устойчивы к реакции среды: оптимумы температуры 50-60 оС, рН 4,2-4,7.

Таким образом, бактериальные амилазы более термостабильны, а грибные амилазы действуют в более кислой среде в сравнении с солодовыми ферментами.

2 Гидролиз белков

Ферментативный гидролиз белков происходит под действием протеолитических ферментов . Они классифицируются на эндо - и экзо-пептидазы. Ферменты не имеют строгой субстратной специфичности и действуют на все денатурированные и многие нативные белки, расщепляя в них пептидные связи - СО-NH-.

Эндопептидазы (протеиназы) – гидролизуют непосредственно белок по внутренним пептидным связям. В результате образуется значительное количество полипептидов и мало свободных аминокислот. Подразделяются в зависимости от оптимума рН на кислые, нейтральные и щелочные. Оптимальные условия действия кислых протеиназ: рН 4,5-5,0, температура 45-50 °С (до 60 оС).

Экзопептидазы (пептидазы) действуют, главным образом, на полипептиды и пептиды, разрывая пептидную связь с конца. Основные продукты гидролиза __ аминокислоты. Данную группу ферментов делят на амино-, карбокси-, дипептидазы.

Аминопептидазы катализируют гидролиз первой пептидной связи, находящейся с N-конца.

H2N - СН - С - - NH - СН - С....

Карбоксипептидазы осуществляют гидролиз первой пептидной связи, находящейся рядом со свободной карбоксильной группой.

СО - NH - С – Н

R

Дипептизады катализируют гидролитическое расщепление дипептидов на свободные аминокислоты. Дипептидазы расщепляют только такие пептидные связи, по соседству с которыми находятся одновременно свободные карбоксильная и аминная группы.

дипептидаза

NH2CH2CONHCH2COOH + Н2О 2CH2NH2COOH

Глицин-глицин Гликокол

Оптимальные условия действия: рН 7-8, температура 40-50 оС. Исключение составляет карбоксипептидаза, проявляющая максимальную активность при температуре 50 оС и рН 5,2.

Недостаточный гидролиз высокомолекулярных азотистых веществ отрицательно влияет на коллоидную стойкость напитков, продукты гидролиза белков (аминокислоты) необходимы для питания дрожжей, пептиды __ формируют полноту вкуса пива, его пеностойкость и пенообразование.

3 Гидролиз некрахмальных полисахаридов

К некрахмальным полисахаридам относятся целлюлоза, гемицеллюлозы, пектиновые и гумми-вещества.

Целлюлоза __ высокомолекулярный полисахарид. Представляет собой длинную неразветвленную цепь остатков глюкозы, соединенных связями β-1,4. Нерастворима в воде. Входит в состав клеточных стенок растений.

Ферментативный гидролиз целлюлозы осуществляют целлюлазы (эндо - и экзоглюканазы ). Продукты гидролиза __ глюкоза и целлобиоза. Однако целлюлоза является сложным субстратом для действия ферментов, так как нерастворима в воде и содержит большое количество примесей. В настоящее время в промышленности полный гидролиз целлюлозы может быть проведен только концентрированными кислотами в очень жестких условиях (высокой температуре и давлении). При этом образуется только Д-глюкоза, а, кроме того, ряд вредных продуктов, от которых необходимо освобождаться.

Гемицеллюлозы также принадлежат к группе полисахаридов. Они не растворимы в воде, но растворимы в щелочах и легче гидролизуются кислотами, чем целлюлоза. Гемицеллюлозы делят на две группы: гексозаны и пентозаны, состоящие из остатков различных моносахаридов и их производных.

Гексозаны __ высокомолекулярные соединения. Могут быть линейные или разветвленные. Основным представителем является β-глюкан, в котором остатки глюкозы соединены β-1,3 и β-1,4-глюкозидными связями.

Пентозаны имеют ветвистое строение, состоят из остатков пентоз (сахаров с пятью атомами углерода) __ ксилозы, арабинозы, а также небольшого количества галактуроновой кислоты. Основной тип связей __ β-1,4, в местах ветвления __ β-1,3. Представителями пентозанов являются ксиланы, арабаны и арабиноксиланы.

Гумми-вещества близки по составу к гемицеллюлозам. Это продукты незавершенного гидролиза или синтеза гемицеллюлоз. Состоят из глюкозы, галактозы, ксилозы, арабинозы и остатков уроновых кислот. Растворимы в горячей воде, дают растворы с высокой вязкостью.

Гидролиз всех вышеназванных соединений идет под действием трех групп цитолитических ферментов: β-глюканаз (например, эндо-β-1,3-глюканаза; экзо-β-1,4-глюканаза), β-ксиланаз и β-глюкозидазы (экзофермент, расщепляет с нередуцирующего конца β-1,4-связь, с образованием глюкозы).

В результате гидролиза некрахмальных полисахаридов образуются глюкоза, арабиноза, ксилоза, уроновые кислоты, декстрины. Оптимальные условия действия цитолитических ферментов: рН 4,5-5,0, температура °С.

Гидролиз некрахмальных полисахаридов особенно интенсивно протекает при солодоращении, что приводит к растворению эндосперма (цитолиз). В пивоварении недостаточный гидролиз этих веществ затрудняет процесс фильтрования сусла и пива, отрицательно влияет на удаление мути, коллоидную стойкость напитка.

Пектиновые вещества __ высокомолекулярные соединения, полисахариды, состоящие из остатков галактуроновой или глюкуроновой кислот, соединенных связями α-1,4. При этом образуется цепочка полигалактуроновой кислоты.

В составе этой цепочки могут быть ответвления в виде остатков метилового спирта СН3О-, часть водородных атомов карбоксильных групп может быть замещена катионами металлов. К этой же цепи могут присоединяться остатки сахаров: галактозы, арабинозы, рамнозы в виде полисахаридной цепочки. Сахаридный комплекс образует нейтральную фракцию пектиновых веществ, а полигалактуроновая цепочка с метоксильными группами __ кислую фракцию.

К пектиновым веществам относят протопектин, пектин, пектиновые кислоты.

Протопектин, или нерастворимый пектин __ нерастворим в воде, имеет сложный химический состав, недостаточно хорошо изучен. Возможно это соединение пектина с другими веществами: целлюлозой, гемицеллюлозой, белками.

Пектин , или растворимый пектин __ полигалактуроновые кислоты, карбоксильные группы которых в различной степени соединены с остатками метилового спирта, т. е. этерифицированы. Молекулярная масса от 01.01.0100. Растворяется в горячей воде. В присутствии сахара и кислот образует студни.

Пектиновые кислоты – высокомолекулярные полигалактуроновые кислоты, не содержащие этерифицированных групп. Плохо растворяются в воде, студни не образуют. Пектиновые кислоты могут образовывать соли с ионами многовалентных металлов, в результате образуются нерастворимые соединения, которые выпадают в осадок.

Пектиновые вещества уменьшают выход соков из плодово-ягодного сырья, затрудняют их осветление, снижают стойкость вин и ликероводочных изделий к коллоидным помутнениям.

Гидролиз пектиновых веществ происходит под действием пектолитических ферментов : протопектиназы, пектинэстразы, полигалактуроназы.

Протопектиназа расщепляет в протопектине связи между метоксилированной полигалактуроновой кислотой и связанными с ней арабаном и галактаном. В результате образуется метоксилированная полигалактуроновая кислота, которая представляет собой растворимый пектин.

Арабан Метоксилированная Галактан

полигалактуроновая кислота

Рисунок 20- Действие протопектиназы

Пектинэстераза (пектаза) принадлежит к группе эстераз и гидролизует эфирные связи растворимого пектина, отщепляя метоксилъные группы от метоксилированной полигалактуроновой кислоты. При этом образуется метиловый спирт (СН3ОН) и полигалактуроновая кислота.

Полигалактуроназа (пектиназа) действует на растворимый пектин, катализируя расщепление α-1,4-глюкозидных связей между остатками галактуроновой кислоты, которые не содержат метоксилъных групп. В результате образуются галактуроновая и полиуроновые кислоты.

По механизму действия различают эндо - и экзополигалактуроназы. Эндополигалактуроназа действует «беспорядочно», разрывает цепь внутри молекулы субстрата, приводит к резкому снижению вязкости растворов.

Экзополигалактуроназа действует с конца цепи, отщепляя галактуроновую кислоту. Под действием этого фермента вязкость снижается незначительно.

Оптимальные условия действия пектолитических ферментов; рН 3,7-4,0, температура 40-50 °С.

4 Ферментные препараты: характеристика и номенклатура

Ферментные препараты широко используются в различных отраслях промышленности. Отличаются они от чистых ферментов тем, что содержат либо один или несколько ферментов с преобладанием какого-либо одного, а также балластные вещества среды, на которой были выращены микроорганизмы – продуценты ферментов.

Для промышленного производства ферменных препаратов используют микроорганизмы, выделенные из природных источников и мутагенные штаммы (получают воздействием химических и физических факторов). Активными продуцентами ферментов являются микроскопические грибы родов Aspergillus (видов oryzae, niger, awamori, batatae, foetidus, flavus и др.), Rhisopus, Penicillium, Fusarium, Trichoderma (вид viride), спороносные бактерии родов Bacillus (видов subtilis, mesentericus, brevis и др.), Clostridium

Наименование препарата начинается с сокращенного названия основного фермента, активность которого преобладает. Затем следует измененное видовое название продуцента и окончание «ин». В наименовании препарата отражается также и способ культивирования микроорганизма-продуцента. При глубинном культивировании после названия ставится буква «Г», при поверхностном – «П».

Условно количество фермента в стандартной культуре обозначается «х». Цифра перед «х» указывает на степень очистки фермента в процессе получения данного препарата.

Например: Амилосубтилин Г10х __ ферментный препарат амилолитического действия, бактериального происхождения, продуцент - бактерии Bacillus subtilis, выращенные глубинным способом, степень очистки 10х, в виде порошка. Пектофоетидин П20х __ высокоочищенный сухой ферментный препарат, обладающий пектолитической активностью, микроорганизм-продуцент __ плесневый гриб Aspergillus foetidus, культивированный поверхностным способом.

Принципиальная схема получения ферментных препаратов приведена на рис.22. Схема очистки фермента от балластных веществ сводится к освобождению его от нерастворимых, сопутствующих растворимых веществ и других ферментов. Из поверхностных культур труднее получить высокоочищенные препараты, так как они содержат много балластных веществ. Из глубинных культур получать очищенные препараты легче. Схема очистки включает различные методы (концентрирование, диализ, осаждение органическими растворителями, солями, гель-фильтрование и др.).

Выпускаемые ферментные препараты представляют собой либо жидкости, либо порошки белого, серого или желтоватого цвета с определенной стандартной активностью ферментов.

Номенклатура отечественных ферментных препаратов:

Пх и Гх - неочищенная стандартная исходная культура продуцента.

П2х и Г2х – жидкий неочищенный концентрат растворимых веществ исходной культуры, освобожденный от нерастворимой части (П2х – концентрат с содержанием сухих веществ 50 %, Г2х – не более 40 %).

ПЗх и ГЗх __ сухие ферментные препараты, полученные высушиванием путем распыления неочищенного раствора фермента (экстракта поверхностной культуры или фильтрата глубинной культуры).

Препараты с маркировкой 2х и 3х являются техническими .

П10х и Г10х __ сухие очищенные препараты, полученные осаждением ферментов из водных растворов органическими растворителями или методом высаливания.

П15х, Г15х __ очищенные ферментные препараты, получены различными методами очистки и фракционирования ферментов.

П20х, Г20х __ высокоочищенные , но не кристаллические ферментные препараты, содержащие до 20-25 % балластных веществ, полученные методом концентрирования и очистки на ультрафильтрационных установках с последующей распылительной сушкой.

Препараты с индексом выше 20х в номенклатуре не используются, так как речь в этих случаях идет о высокоочищенных и даже гомогенных ферментных препаратах, которые именуются в классификации ферментов.

Любой ферментный препарат должен быть охарактеризован по его ферментативной активности, обычно выражаемой в стандартных единицах. Стандартная единица активности __ это такое количество фермента, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата за единицу времени (1мин.) в стандартных условиях (температура 30 оС).

В бродильных производствах широко используются следующие ферментные препараты:

Амилолитического действия (Амилоризин Пх, П3х, П10х; Амилосубтилин Г3х, Г10х, Г20х; Глюкоаваморин Пх и др.);

Протеолитического действия (Протосубтилин Г20х, Протооризин П10х);

Цитолитического действия (Цитороземин Пх, П10х; Целловиридин Г3х, П10х; Целлоконингин П10х и др.);

Пектолитического действия (Пектаваморин Г3х, Пектофоетидин Г3х, Г10х, Г20х).

В производстве спирта замена солода ферментными препаратами позволяет сэкономить ценное пищевой сырье, снизить капитальные расходы на строительство солодовен, улучшить условия труда работающих, ускорить технологические процессы, увеличить выход готовой продукции .

В пивоварении применение ферментных препаратов позволяет перерабатывать повышенное количество несоложеного сырья, повысить коллоидную стойкость пива.

В производстве соков и вин препараты ферментов применяют для обработки мезги с целью повышения выхода сока, а также для осветления соков и виноматериалов.

5 Иммобилизованные ферменты

В настоящее время ферментные препараты широко применяются в различных отраслях промышленности. Однако ферментные препараты __ дорогостоящие катализаторы. Кроме того, так как они растворимы, использовать их можно только однократно. Поэтому, невозможно перевести периодические процессы на непрерывные, остановить ферментативную реакцию в нужный момент.

Перспективным является использование иммобилизованных ферментов . Они представляют собой нерастворимые биокатализаторы, в которых фермент связан с каким-либо носителем или заключен в матрицы либо микрокапсулы. При этом ферменты сохраняют свою активность и специфичность, становятся более устойчивыми к реакции среды, могут участвовать в непрерывных процессах, использоваться многократно.

Носители, с которым связан фермент, должны быть нерастворимыми, обладать химической и биологической стойкостью, высокой механической прочностью, зернистые носители иметь однородную форму и большую удельную поверхность. В качестве носителей используют природные полимеры (производные целлюлозы, агарозы, декстрана), синтетические (полистирол, акриламид, нейлон), а также пористое стекло, окисленные металлы, глину, силикагелъ, ткань, бумагу и др.

Иммобилизация ферментов может быть осуществлена двумя способами: без образования ковалентных связей между матрицей и белковой молекулой фермента (физические методы) и с образованием ковалентной связи (химические методы).

Физические методы иммобилизации . Для получения стабильных нерастворимых форм ферментов широко используется способность белков адсорбироваться на различных поверхностях. Часто сорбция ферментов бывает малоэффективной из-за того, что близки изоэлектрическая точка белка и оптимум рН каталитической активности. Прочная сорбция наблюдается лишь в тех областях рН, где мала каталитическая активность. Чтобы преодолеть это противоречие, предложен метод иммобилизации предварительно модифицированных (путем введения ионогенных групп) белков. Модификация приводит к сдвигу изоэлектрической точки ферментативного белка, при этом его каталитическая активность практически не меняется. В результате модифицированный фермент хорошо сорбируется на носителях.

Химические методы . Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей является в настоящее время доминирующим способом получения биокатализаторов длительного действия. Преимущества этого способа в том, что фермент не переходит в раствор даже при очень длительном использовании. Химический способ является основным при получении иммобилизованных ферментных препаратов.

Химическая иммобилизация может быть осуществлена как на полимерном носителе, так и за счет поперечной сшивки молекул белка без использования носителя. В последнем случае возможно получать нерастворимые препараты с высокой удельной активностью, однако по своим технологическим свойствам они малоперспективны для промышленного применения.

Традиционным является химический метод образования ковалентной связи между носителем и ферментативным белком за счет химического взаимодействия. Наиболее частыми здесь являются реакции ацилирования, алкилирования, окислительно-восстановительные, радикальные, образования иминов.

Иммобилизованные ферменты по своим свойствам отличаются от нативных, так как в результате иммобилизации изменяется пространственная структура белковой молекулы. Активность иммобилизованных ферментов в большинстве случаев уменьшается за счет модификации молекулы фермента, экранирования активного центра. Но, несмотря на это, иммобилизация приводит к повышению стабильности ферментов в более широком диапазоне рН и температуры, что важно при длительном использовании ферментов, а также к стабильности их при хранении.

Положительным является и то, что иммобилизованные ферменты более устойчивы к действию ингибиторов. Оптимальные значения рН и температуры не меняются. При иммобилизации в пористых носителях ферменты становятся недоступными для действия микроорганизмов, так как размеры пор носителя меньше размеров клеток микроорганизмов.

Контрольные вопросы

1 Поясните роль гидролитичеких ферментов в технологии бродильных производств.

2 Охарактеризуйте действие гидролитических ферментов на крахмал, некрахмальные полисахариды, белки.

3 Укажите оптимальные параметры действия амилолитических, протеолитических, цитолитических ферментов.

4 Назовите основные продукты гидролиза крахмала, белков, гемицеллюлоз, пектиновых и гумми-веществ.

5 Охарактеризуйте роль амилаз, протеаз, цитаз, пектолитических ферментов в производстве напитков брожения .

6 Поясните, чем ферментный препарат отличается от фермента.

7 Как складывается название ферментного препарата.

8 Назовите основные бродильные производства, где используются ферментные препараты, и с какой целью.

9 Что такое иммобилизация ферментов.

10 Какие преимущества имеют иммобилизованные ферменты по сравнению с растворимыми.

3 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИЗУЧЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ

«Общая технология отрасли» (ОТО) является первой среди комплекса профилирующих дисциплин, где студенты знакомятся, что такое технология вообще и технология бродильных производств, в частности. Курс базируется на знаниях, полученных ранее при изучении химии, биохимии, микробиологии, процессов и аппаратов пищевых производств.

Освоение материала данной дисциплины позволяет студенту приобрести знания теоретических основ технологии бродильных производств, закономерностей роста и развития микроорганизмов, характеристик и свойств сырья, ферментов.

Работа по изучению курса ОТО должна быть регулярной, последовательной и систематичной. Необходимо проработать курс лекций, а также специальную литературу, список которой приведен в конце методического комплекса.

Изучение того или иного материала должно быть активным, действенным , т. е. каждое понятие, теоретическое положение, практический прием должны быть поняты и уяснены глубоко и детально.

При изучении курса следует идти от уяснения общего к детальному разбору частного с последующей повторной оценкой общего на более высоком уровне.

Глубину самостоятельного усвоения основного материала можно проверить по вопросам для самоконтроля, приведенным после каждой темы лекций.

4 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ВЫПОЛНЕНИЮ КОНТРОЛЬНЫХ РАБОТ

Контрольные работы, выполняемые студентами во время самостоятельного изучения дисциплины, дают представление о степени подготовленности студентов, об их умении работать со специальной литературой и излагать материал в письменном виде, и позволяют судить об общей эрудиции и грамотности обучающихся.

Контрольные работы выполняют в виде подробных рукописных или печатных рефератов, иллюстрированных схемами, графиками, диаграммами, рисунками, которые могут быть заимствованы из специальной литературы (учебников, учебных пособий , научных и отраслевых журналов). Недопустимо механическое, дословное переписывание материала из учебников и других литературных источников.

2 Биохимические процессы, идущие в зерне при хранении: послеуборочное дозревание, дыхание, самосогревание.

Вариант 9

1 Строение дрожжевой клетки.

2 Способы хранения зерна.

Вариант 10

1 Химический состав дрожжевой клетки.

2 Режимы хранения зерна.

Вариант 11

1 Химический состав и строение биомембран по современным представлениям.

2 Меласса: характеристика, виды, химический состав.

Вариант 12

1 Способы переноса веществ через мембрану

2 Хмель: характеристика, строение, химический состав, хранение.

Вариант 13

1 Производственная инфекция, ее источники.

2 Картофель: характеристика, строение, химический состав.

Вариант 14

1 Метаболизм дрожжевой клетки.

2 Виноград: строение, химический состав.

Вариант 15

1 Схема спиртового брожения.

2 Виды сырья, применяемые в производстве пива, кваса, спирта, вина, хлебопекарных дрожжей.

Вариант 16

1 Вторичные и побочные продукты спиртового брожения.

Вариант 17

1 Дрожжи верхового и низового брожения, их сравнительная характеристика.

2 Способы и режимы хранения картофеля.

Вариант 18

1 Расы дрожжей, применяемые в производстве спирта, пива, вина, хлебопекарных дрожжей и требования к ним.

2 Доставка и хранение мелассы.

Вариант 19

1 Условия роста и размножения дрожжей. Чистая культура дрожжей.

2 Химизм и основные продукты дыхания.

Вариант 20

1 Функции биомембран.

2 Вредители зерна, борьба с ними.

Вариант 21

1 Показатели общего значения зерновых культур.

2 Влияние рН, активаторов и ингибиторов на жизнедеятельность микроорганизмов.

Вариант 22

1 Показатели технологического значения зерновых культур.

Вариант 12

1 Окисляемость воды. Содержание сухого остатка.

2 Ферментные препараты: их характеристика и номенклатура.

Вариант 13

1 Биологические показатели воды.

2 Применение ферментных препаратов в производстве пива, спирта.

Вариант 14

1Требования к воде в производстве ликероводочных и безалкогольных напитков.

2 Микроорганизмы-продуценты ферментов.

Вариант 15

1 Подготовка воды в бродильных производствах. Коагуляция коллоидов, дезодорация воды, обезжелезивание.

2 Иммобилизованные ферменты.

Вариант 16

1 Способы умягчения воды.

1 Применение ферментных препаратов в производстве вин и ликероводочных изделий.

Вариант 17

1 Способы обеззараживания воды.

2 Принципиальная схема производства ферментных препаратов.

Вариант 18

1Требования к воде в производстве солода.

2 Способы снижения жесткости воды: термический, реагентный, ионообменный.

Вариант 19

1 Способы осветления воды.

2 Механизм действия ферментов.

Вариант 20

1 Ферменты зерновых культур.

2 Показатели воды производственного назначения.

Вариант 21

1Ферменты микроорганизмов.

2 Требования к воде в различных бродильных производствах.

Вариант 22

1 Ферментативный гидролиз крахмала.

2 Способы умягчения воды обратным осмосом, электродиализом.

Вариант 23

1 Ферментативный гидролиз белков.

2 Биологические способы очистки сточных вод.

Вариант 24

1 Гидролиз некрахмальных полисахаридов.

2 Показатели загрязненности сточных вод.

Вариант 25

1 Пектиновые вещества и их гидролиз.

2 Сточные воды предприятий бродильной промышленности.

5 ВОПРОСЫ К ЭКЗАМЕНУ

1 Микроорганизмы, используемые в бродильных производствах.

2 Стадии развития культур микроорганизмов.

3 Методы культивирования микроорганизмов: периодический и непрерывный.

4 Влияние на жизнедеятельность микроорганизмов окислительно-восстановительного потенциала.

5 Влияние температуры на рост и размножение микроорганизмов.

6 Влияние концентрации сухих веществ среды на жизнедеятельность микроорганизмов. Плазмолиз, плазмоптис.

7 Взаимоотношения микроорганизмов: симбиоз, метабиоз, антагонизм.

8 Строение дрожжевой клетки.

9 Химический состав дрожжевой клетки.

10 Химический состав и строение биомембран по современным представлениям.

11 Функции биомембран.

12 Транспорт веществ в клетку, виды транспорта.

13 Способы переноса веществ через мембрану (юнипорт, симпорт, антипорт).

14 Производственная инфекция, ее источники. Способы дезинфекции.

15 Основные свойства ферментов как катализаторов и белковых веществ.

16 Классификация ферментов по типу катализируемых реакций.

17 Регулирование активности ферментов: конкурентные, неконкурентные ингибиторы, аллостерические регуляторы.

18 Каталитическая активность ферментов. Стандартная единица активности фермента, удельная активность.

19 Влияние температуры и рН на активность ферментов.

20 Влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции.

21 Действие гидролитических ферментов: ферментативный гидролиз крахмала, гидролиз некрахмальных полисахаридов, гидролиз белков.

22 Ферменты зерновых культур и микроорганизмов.

23 Ферментные препараты и их номенклатура.

24 Применение ферментных препаратов в производстве пива, спирта, в виноделии.

25 Метаболизм дрожжевой клетки.

26 Оптимальные условия жизнедеятельности дрожжей.

27 Схема спиртового брожения.

28 Вторичные и побочные продукты спиртового брожения.

29 Дрожжи верхового и низового брожения, их характеристика.

30 Расы дрожжей, применяемые в производстве спирта, пива, вина, хлебопекарных дрожжей и требования к ним.

31 Классификация сырья в бродильных производствах.

32 Экономические и технологические требования, предъявляемые к сырью в бродильных производствах.

33 Виды сырья, применяемые в производстве пива, спирта, вина, хлебопекарных дрожжей.

34 Виды зерновых культур.

35 Строение зерна (на примере ячменя).

36 Химический состав зерновых культур.

37 Физические свойства зерновой массы.

38 Биохимические процессы, идущие в зерне при хранении: послеуборочное дозревание, дыхание, самосогревание.

39 Способы хранения зерна.

40 Режимы хранения зерна.

41 Вредители зерна, борьба с ними.

42 Х мель, виноград, картофель: химический состав и хранение.

43 Химический состав мелассы и условия хранения.

44 Характеристика природных вод. Примеси воды.

45 Использование воды в производстве. Общие требования к воде.

46 Жесткость воды: временная, постоянная, общая. Единицы измерения.

47 Щелочность воды.

48 Окисляемость воды. Содержание сухого остатка.

49 Биологические показатели воды.

50 Технологическое назначение воды. Требования к воде в производстве пива, спирта, солода, хлебопекарных дрожжей.

51 Требования к воде в производстве ликероводочных и безалкогольных напитков.

52 Подготовка воды в бродильных производствах. Коагуляция коллоидов, дезодорация воды, обезжелезивание.

53 Способы умягчения воды.

54 Способы обеззараживания воды.

55 Сточные воды бродильных производств, их характеристика. ХПК, БПК.

56 Очистка сточных вод бродильных производств.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИИЙ СПИСОК

1 Болдырев в биохимию мембран.__ М.: Высшая школа, 1986.__ 112 с.

2 Вода и сточные воды в пищевой промышленности .– М.: Пищевая промышленность, 1972. – 384 с.

3 Грачева ферментных препаратов. – М.: Агропромиздат, 1987. – 335 с.

4 Достижения в технологии солода и пива/ Под ред. КолпакчиА. И. __ М.: Пищевая промышленность, Прага: СНТЛ-Издат. технической литературы , 1980. __ 351 с.

5 , Бакушинская микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности.– М.: Пищевая промышленность, 1977. – 501 с

6 , Фараджева: их роль в технологии пищевых продуктов. __ Воронеж: Изд. ВГУ, 1999. __ 118 с.

7 Лхотский А. Ферменты в пивоварении. __ М.: Пищевая промышленность, 1975. __ 318 с.

8 Мальцев бродильных производств.– М.: Легкая и пищевая промышленность, 1980.– 560 с.

9 Методы исследования качества сырья, полупродуктов и готовой продукции бродильных производств. Ч.1. «Анализ сырья бродильных производств» Лабораторный практикум. , Пермякова ТИПП. __ Кемерово, 2001. – 67 с.

10 , Шишацкий хлебопекарных дрожжей. Справочник. __ М.: Агропромиздат, 1990. – 335 с.

11 Справочник по производству спирта. Сырье, технология и технохимконтроль/ , и др. __ М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981.– 336 с.

12 , Федоров технология бродильных производств. __ М.: Колос, 2002. __ 408 с.

13 Ферментные препараты в пищевой промышленности. /Под ред. и. – М.: Пищевая промышленность, 1975. – 535 с.

14 Хмель и хмелевые препараты в пище-вой промышленности /, и др. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. – 168 с.

15 , Пономарев переработки винограда. – М.: Агропромиздат, 1990. – 447 с.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МУЛЬТИЭНЗИМНОГО КОМПЛЕКСА ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ООО «РУСФЕРМЕНТ» НА РАЗЛИЧНЫХ СХЕМАХ ВОДНО-ТЕПЛОВОЙ ОБРАБОТКИ ЗЕРНОГО СЫРЬЯ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ СПИРТА

Компания ООО «РУСФЕРМЕНТ» располагает большим ассортиментом ферментных препаратов широкого спектра действия. Имея такой ассортимент, удается подобрать мультиэнзимный комплекс препаратов, который позволяет гидролизовать как крахмалистую часть зерна, так и некрахмалистые полисахариды и белок.

Основной составляющей зерновых культур, используемых для производства спирта, является крахмал. Этот полисахарид (α-1,4-глюкан) имеет высокую молекулярную массу и состоит из 10000-100000 глюкозных остатков, связанных химическими α-глюкозидными связями в длинные цепи. Крахмал состоит из линейной амилозы (чистый α-1,4-глюкан) и разветвленного амилопектина (α-1,4-глюкан, содержащий 5-6 % α-1,6-связей), причем соотношение между ними варьируется в зависимости от вида зерна. В растительной клетке крахмал находится в виде крахмальных зерен, которые окружены оболочкой из трудногидролизуемых некрахмальных полисахаридов – целлюлозы, ксиланов (пентозанов) и бета-глюканов.

В процессе водно-тепловой обработки зерна основная часть крахмала переходит в раствор, и как следствие, на несколько порядков, возрастает вязкость (эффект клейстеризации).При этом часть крахмала остается в исходном состоянии, поскольку некрахмальные полисахариды (НПС), образуют пространственную сетку вокруг зерен крахмала и препятствуют его выходу в раствор.

Расщепление крахмала до глюкозы под действием ферментов можно разделить на 3 этапа. На первом происходит набухание зерен крахмала и растворение полимерной молекулы.

На втором этапе крахмал расщепляется под действием фермента альфа-амилазы с образованием декстринов (олигосахаридов, имеющих молекулярную массу меньше, чем исходный крахмал).

На третьем этапе декстрины под действием фермента глюкоамилазы превращаются в глюкозу и мальтозу, которые затем сбраживаются дрожжами в спирт.

Альфа-амилазы по механизму своего действия на субстрат (крахмал) относятся к классу эндополимераз, они осуществляют хаотический гидролиз внутренних связей в полимерной молекуле крахмала.

Глюкоамилазы, напротив, относятся к классу экзополимераз, они атакуют субстрат с конца, последовательно отщепляя глюкозные (и мальтозные) остатки от более крупных молекул.

Глюкоамилазы проявляют наибольшую активность по отношению к небольшим молекулам мальтодекстринов, содержащих 5-50 глюкозных остатков, и очень незначительную активность по отношению к исходному крахмалу.Именно поэтому глюкоамилазы применяются после частичного разрушения крахмала под действием альфа-амилаз.

В различных видах зерна содержание и состав крахмальной части и некрахмалистых полисахаридов (НПС) может различаться (таблица 1). НПС, несмотря на сходство с крахмалом, не могут гидролизоваться под действием амилаз. Поэтому, для повышения степени утилизации крахмала и, естественно, увеличения выхода спирта, целесообразно применять ферментные препараты, гидролизующие НПС.

Для гидролиза пентозанов применяются препараты, содержащие фермент ксиланазу, для гидролиза бета-глюканов – β-глюконазу, для гидролиза целлюлозы – целлюлазу. Наиболее целесообразно применять ферментные препараты, содержащие в своем составе комплекс ферментов, гидролизующих НПС.

Таблица 1 Содержание основных компонентов углеводов в зерновом сырье (%).

Зерно	Крахмал	Пентозаны	β-глюкан	Целлюлоза	Сахара	Белок	Жир
Пшеница	55-65	6,0-6,6	0,7-0,8	2,5-3,0		9-15(до25)	1,7-2,3
Рожь	52-60	8,7-10,0	2,2-2,8		2,2-2,8	10-12
Ячмень	53-57		5,7-7,0
Кукуруза	60-65					8-12	4,0-8,0

Также известно, что при водно-тепловой обработке зернового сырья часть белка переходит в раствор, а его большая часть образует стойкие гели с некрахмалистыми полисахаридами. В последнее время возросла доля белка в зерне - в пшенице доходит до 25% , а во ржи до 15%. Нерастворенный белок является источником инфекции, откладывается на оборудовании и в виде нагара на БРУ. Поэтому, гидролиз зернового белка – производственная необходимость, позволяющая:

Сохранить аминокислоты
- снизить пенообразование
- облегчить мойку оборудования
- увеличить доступ амилолитических ферментов к субстрату
- повысить выход спирта

На сегодня производственниками все чаще используются протеолитические ферменты и эффект от их применения очевиден.

Таким образом, на основании приведенных данных по составу зерна и используемых ферментных препаратов с широким диапазоном действия нашей компании, нами разработаны таблицы оптимизации внесения ферментных препаратов для различных схем водно-тепловой обработки.

ПРОИЗВОДСТВО ЭТАНОЛА

Мировой рынок этанола составляет около 4 млрд. дал (декалитров абсолютного алкоголя) в год. Лидерами в производстве этанола являются США, Бразилия, Китай. В США функционирует 97 заводов по производству этанола из кукурузы (строится еще 35 заводов) общей мощностью 1,5 млрд. дал в год.

Основные направления использования этанола в мировой практике:

− 60% − добавка к моторному топливу;

− 25% − химическая промышленность;

− 15% − пищевая промышленность (доля ее сокращается).

Автомобильное топливо на основе этанола содержит 10% этанола (топливо Е-10) или 85% этанола (Е 85). При стоимости нефти 60-70 $ за баррель биоэтанол становится конкурентоспособным топливом. Введение этанола в бензин позволяет отказаться от добавки в топливо тетраэтилсвинца, в результате чего снижается токсичность выхлопных газов и расход горючего.

В США проводятся масштабные исследования по производству биоэтанола из возобновляемого растительного сырья (из стеблей кукурузы, тростника и др.)

В промышленных условиях этанол получают гидратацией этилена в присутствии катализатора (H 3 PO 4 на силикагеле), из гидролизатов растительного сырья (древесины, стеблей кукурузы, тростника), а также из крахмалсодержащего сырья (пшеница, рожь, тритикале, картофель), мелассы, молочной сыворотки, топинамбура. Средний выход 95,5%-ного этилового спирта из 1 т различных видов сырья представлен в таблице 2.1.

Таблица 2.1

Выход этанола из различных видов сырья

Окончание таблицы 2.1

На спиртовых заводах Республики Беларусь (функционирует около 70 спиртовых заводов общей мощностью более 9 млн. дал в год) для производства этанола используют крахмалсодержащее сырье, главным образом зерно злаков. Содержание крахмала в различных видах зерна составляет (в %): пшеница – 48–57; рожь – 46–53; ячмень – 43–55; овес – 34–40; просо – 42–60; кукуруза – 61–70. В зерне содержатся также (в среднем) сахара ~ 3%; клетчатка ~ 6%; пентозаны и пектиновые вещества ~ 9%; азотистые (белковые) вещества ~ 11%, жир ~ 3%.

Продуценты этанола

При микробиологическом синтезе классическими продуцентами этанола являются дрожжи - сахаромицеты и шизосахаромицеты. Чаще других используют дрожжи Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces vini , Schizosaccharomyces pombe .

Сахаромицеты имеют клетки округлой формы размером 10-15 мкм, размножаются почкованием. Шизосахаромицеты имеют крупные палочковидные клетки диаметром 4-5 мкм и длиной 18-20 мкм, размножаются делением. И те, и другие дрожжи хорошо сбраживают глюкозу, маннозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, труднее сбраживают галактозу и не сбраживают пентозные сахара (ксилозу, арабинозу).

Теоретический выход этанола из 100 кг сброженной глюкозы составляет 51,14 кг или 64,80 л (при этом образуется 48,86 кг СО 2). На практике выход спирта составляет 82-92% от теоретического в связи с расходом части субстрата на размножение и рост дрожжей и образование побочных продуктов.

Синтез этанола в дрожжевой клетке осуществляется по следующей схеме:

Побочными продуктами спиртового брожения являются глицерин, высшие (сивушные) спирты, органические кислоты (уксусная, пировиноградная, молочная, янтарная), альдегиды. При спиртовом брожении сахар (глюкоза) расходуется на образование различных веществ в следующем количестве: этанола - 46-47%, диоксида углерода - 44-46%, биомассы дрожжей - 1,8-4,0%, глицерина - 3-4%, высших спиртов - 0,3-0,7%, органических кислот - 0,2-1,0%, альдегидов - 0,1-0,2%. При многократном возврате дрожжей на брожение расход сахара на образование биомассы сокращается, а интенсивность брожения даже несколько возрастает.

Образование глицерина при спиртовом брожении объясняется тем, что в индукционный период (до образования уксусного альдегида) между двумя молекулами фосфоглицеринового альдегида под действием фермента альдегидмутазы при участии молекулы воды происходит реакция дисмутации. При этом одна молекула фосфоглицеринового альдегида восстанавливается, образуя фосфоглицерин, а другая окисляется в 3-фосфоглицериновую кислоту. Фосфоглицерин в дальнейших реакциях не участвует и после отщепления фосфорной кислоты является побочным продуктом спиртового брожения. 3-фосфогли-цериновая кислота претерпевает превращения по ЭМП-пути с образованием уксусного альдегида. После появления уксусного альдегида наступает стационарный период брожения, при котором окисление фосфоглицеринового альдегида в фосфоглицериновую кислоту протекает более сложным путем, с присоединением неорганического фосфата (ЭМП-путь). В связи с этим наряду с этанолом при брожении всегда образуется некоторое количество глицерина.

При связывании уксусного альдегида бисульфитом процесс брожения направляется в сторону образования глицерина:

С 6 Н 12 О 6 ® СН 3 СНО + СО 2 + СН 2 ОН-СНОН-СН 2 ОН.

В щелочной среде молекула уксусного альдегида вступает в окислительно-восстановительную реакцию со второй молекулой, образуя этанол и уксусную кислоту. Одновременно идет накопление глицерина. Суммарно процесс выражается следующим уравнением:

2С 6 Н 12 О 6 + Н 2 О ® ® 2СН 2 ОН-СНОН-СН 2 ОН + С 2 Н 5 ОН + СН 3 СООН + 2СО 2 .

Эти приемы используются для промышленного получения глицерина.

Высшие спирты образуются из аминокислот (в меньшей степени из кетокислот), содержащихся в ферментационной среде, в результате последовательно протекающих реакций дезаминирования аминокислот, декарбоксилирования образовавшихся кетокислот и восстановления альдегидов.

Из высших спиртов в бражке присутствуют: пропиловый (образуется из треонина), изобутиловый (из валина), амиловый (из изолейцина) и изоамиловый (из лейцина).

В настоящее время ведется интенсивный поиск нетрадиционных микроорганизмов-продуцентов этанола, способных сбраживать широкий круг субстратов, имеющих высокую продуктивность по этанолу, обладающих повышенной устойчивостью к этанолу и высокой температуре. Представляют интерес этанолсинтезирующие бактерии. Например, бактерии Zymomonas mobilis отличаются от дрожжей интенсивным метаболизмом: имеют высокую удельную скорость конверсии глюкозы в этанол, обеспечивают более высокий выход этанола (до 95% от теоретически возможного), более толерантны к спирту. Но эти бактерии чувствительны к присутствию в питательных средах ингибиторов (фурфурола, фенолов) и требуют осуществления процесса брожения в условиях асептики.

Термофильные бактерии Clostridium thermocellum (оптимальная температура роста 68°С) способны непосредственно трансформировать целлюлозу растительного сырья в этанол, но при этом сырье должно быть освобождено от лигнина. Достичь высокого выхода спирта при прямой конверсии растительного сырья пока не удается.

Получены штаммы дрожжей, способные сбраживать пентозные сахара (Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis, Candida shehata ). Выход этанола при сбраживании 100 кг ксилозы достигает 35-47 л.

В отечественной практике производства этанола из крахмалсодержащего сырья используют дрожжи Saccharomyces cerevisiae , имеющие оптимальную температуру брожения 29–30°С.

Ферментативное осахаривание крахмала

Традиционные продуценты этанола не способны к расщеплению полисахаридов, поэтому при получении сусла крахмалсодержащее сырье подлежит развариванию и осахариванию. Крахмал большинства растений содержит 20-25% амилозы и 80-75% амилопектина. В растительных клетках крахмал находится в виде зерен (гранул), размер которых колеблется от 1 до 120 мкм (картофельный крахмал имеет гранулы размером 40-50 мкм, гранулы крахмала зерна − 10-15 мкм). Крахмал, амилоза и амилопектин нерастворимы в холодной воде, спирте, эфире. Амилоза легко растворяется в теплой воде, амилопектин - при нагревании под давлением. Сетчатая структура молекул амилопектина обусловливает набухание крахмальных гранул без их растворения (вторичные связи ослабляются гидратацией). При определенной температуре гранулы разрыхляются, разрываются связи между отдельными структурными элементами, нарушается целостность гранул. При этом резко возрастает вязкость раствора - происходит клейстеризация крахмала. Для клейстера характерны беспорядочное расположение молекул, потеря кристаллической структуры. При температуре 120–130°С клейстер становится легкоподвижным. Наиболее полное растворение амилопектина происходит у пшеничного крахмала при 136–141°С, у картофельного - при 132°С.

Растворенный при разваривании зерна или картофеля крахмал гидролизуют (осахаривают) амилолитическими ферментами зернового солода или культур микроорганизмов, преимущественно мицелиальных грибов и бактерий. Из растительных материалов наиболее богато амилолитическими ферментами пророщенное зерно злаков, называемое солодом. В настоящее время в спиртовой промышленности широко применяют ферментные препараты на основе культур мицелиальных грибов (или бактерий рода Bacillus ), которые имеют ряд преимуществ по сравнению с солодом. Культуры мицелиальных грибов выращивают на пшеничных отрубях или кукурузной муке, тогда как для получения солода требуется кондиционное зерно. С солодом в сусло вносятся в большом количестве посторонние микроорганизмы, что отрицательно сказывается на выходе этанола. Глубинные культуры грибов выращивают в стерильных условиях, они не загрязняют сусло посторонними микроорганизмами. Выращивание поверхностной культуры грибов осуществляется намного быстрее (1,5-2,0 сут), чем протекает проращивание зерна (9-10 сут). Грибы образуют комплекс ферментов, которые глубже гидролизуют крахмал, а также расщепляют гемицеллюлозы до моносахаридов, что повышает выход этанола из сырья.

В процессе осахаривания крахмалсодержащего сырья участвуют различные ферменты. Наибольшее производственное значение имеют амилазы. α- и β-амилазы катализируют разрыв только α-1,4-глюкозидных связей. Под действием α-амилаз связи разрываются беспорядочно, но преимущественно внутри цепей. В результате образуются главным образом декстрины, небольшое количество мальтозы и олигосахаридов. Исходя из характера действия, α-амилазу называют эндогенной или декстриногенной амилазой.

Дейстивие β-амилазы направлено на концевые (внешние) связи в крахмале, при этом последовательно, начиная с нередуцирующих концов цепей, отщепляется по два остатка глюкозы (мальтоза). β-амилаза не может обойти места ветвления в макромолекуле крахмала, поэтому гидролиз прекращается на предпоследней α-1,4-глюкозидной связи и остаются высокомолекулярные декстрины при гидролизе амилопектина. Амилоза практически полностью превращается β-амилазой в мальтозу, амилопектин – только на 50–55%.

В результате совместного действия α- и β-амилаз образуется смесь сахаридов, состоящая из мальтозы, небольшого количества глюкозы и низкомолекулярных декстринов, в которых сосредоточены все α-1,6-глюкозидные связи крахмала.

В бактериях и микроскопических грибах отсутствует β-амилаза, но содержится активная α-амилаза, отличающаяся композицией аминокислот в белке и специфичностью действия. В частности, при катализе α-амилазой микроскопических грибов образуется большое количество глюкозы и мальтозы. Среди бактериальных амилаз имеются как сахарогенные, так и декстриногенные. Первые гидролизуют крахмал на 60% и более, вторые – на 30–40%. α-Амилазы микробного происхождения, как и α- и β-амилазы солода, не атакуют α-1,6-глю-козидные связи.

В микроскопических грибах содержится глюкоамилаза, которая катализирует разрыв α-1,4- и α-1,6-глюкозидных связей в крахмале. При катализе этим ферментом от нередуцирующих концов амилозы и амилопектина последовательно отщепляются остатки глюкозы. По месту разрыва связей присоединяется молекула воды, поэтому теоретический выход глюкозы в процессе гидролиза составляет 111,11% к массе крахмала.

Известны три вероятных способа взаимодействия фермента с субстратом (содержащим большое количество цепей): многоцепочный, одноцепочный и комбинированный.

По многоцепочному способу молекула фермента в случайном порядке атакует одну из полисахаридных цепей, отщепляя от нее звено, а затем также в случайном порядке атакует следующие цепи, в том числе, возможно, и атакованную ранее. Таким образом, за время существования фермент-субстратного комплекса происходит только один каталитический акт.

При одноцепочном способе молекула фермента, атаковав в случайном порядке одну из полисахаридных цепей, последовательно отщепляет от нее звенья до полного расщепления цепи. За время существования фермент-субстратного комплекса гидролизуются все доступные для фермента связи.

Комбинированный способ, или способ множественной атаки, заключается в том, что за время существования фермент-субстратного комплекса гидролизуется несколько связей. При этом после отщепления одного звена фермент не отталкивается, а задерживается. Атака происходит с чередованием одно- и многоцепочного способов.

Исследования показали, что α- и β-амилазы осуществляют гидролиз по способу множественной атаки (многоцепочный способ характерен для α-амилазы бактерий).

На отечественных спиртовых заводах для осахаривания крахмала сырья применяют сырцовый (несушенный) солод в виде солодового молока, ферментные препараты (глюкаваморин, амилоризин, амилосубтилин) различного уровня активности или смесь солодового молока и ферментного препарата.

Технология получения солода включает следующие основные процессы: замачивание сырья с достижением влажности 38–40%; проращивание зерна в течение 10 сут в пневматической солодовне в слое толщиной 0,5–0,8 м; измельчение солода в дисковых или молотковых дробилках; дезинфекция солода формалином или раствором хлорной извести и приготовление солодового молока. Солодовое молоко получают смешиванием измельченного солода с водой (4–5 л воды на 1 кг солода).

В солоде, приготовленном из зерна различных злаков, содержится неодинаковое количество каждого из амилолитических ферментов. Например, солод из ячменя имеет высокую α- и β-амилолитическую активность, а солод из проса отличается сильной декстринолитической активностью. Чаще всего готовят смесь из трех видов солода: ячменного (50%), просяного (25%) и овсяного (25%). Запрещается использовать солод из одной культуры при производстве спирта из той же культуры.

Ферментативный гидролиз крахмала

Основным процессом при переработке крахмалсодержащего сырья в бродильных производствах является гидролиз крахмала амилолитическими ферментами солода и ферментных препаратов. Углеводная часть крахмала состоит из двух полисахаридов: амилозы и амилопектина.

Амилоза и амилопектин построены из остатков глюкозы С 6 Н 10 О 5 . Амилоза имеет молекулярную массу 3·10 5 – 1·10 6 , молекулярная масса амилопектина достигает сотен миллионов. Схема строения молекулы амилозы представлена в виде длинной цепочки глюкозных остатков, связанных глюкозидными α-1,4-связями. В молекуле амилозы соединены несколько таких параллельно расположенных цепочек. В каждой из них глюкозные остатки расположены по спирали. Схема строения молекулы амилопектина представлена в виде разветвленной цепи, состоящей из большого числа глюкозных остатков (около 2500). Главная цепочка, к которой присоединяются боковые ветви, состоит из 25 – 30 глюкозных остатков. Каждая же отдельная боковая ветвь состоит из 15 – 18 остатков, а внутренние отрезки цепей (между ветвления) – из 8 – 9 таких остатков. Боковые цепочки, в свою очередь, связаны с соседними цепочками. В амилопектине остатки глюкозы в пределах одной цепочки связаны между собой, так же как в амилозе, α-1,4-связью. Но связь между отдельными цепочками в амилопектине осуществляется α-1,6-глюкозидными связями.

Ферментативный гидролиз крахмала проводится амилолитическими ферментами. Амилолитический комплекс солода (проросшего зерна) состоит из α- и β-амилазы и декстриназы (олиго-α-1,6-глюкозидазы). В ферментных препаратах присутствуют α-амилаза, олиго-α-1,6-глюкозидаза и глюкоамилаза. Каждый фермент имеет свои специфические особенности, которые обусловливают определенные качественные характеристики получаемых продуктов.

α-Амилаза – эндофермент, гидролизующий α-1,4-связи внутри молекулы амилозы и амилопектина. Механизм действия фермента многоцепочный, неупорядоченный; в результате образуются продукты неполного гидролиза крахмала – α-декстрины, поэтому α-амилазу называют декстринирующим ферментом. При длительном действии α-амилазы на амилозу фермент почти полностью превращают ее в мальтозу и небольшое количество глюкозы.

Действие α-милазы на амилопектин приводит к образованию мальтозы и низкомолекулярных декстринов с 5 – 8 глюкозными остатками. Такое поведение α-амилазы обусловлено тем, что фермент не действует на α-1,6-глюкозидные связи в местах разветвления макромолекул амилопектина.

β-Амилаза – экзофермент, гидролизующий α-1,4-связи с нередуцирующих концов молекул амилозы и амилопектина с образованием мальтозы. Она является сахарофицирующим ферментом, который не расщепляет α-1,6-связи.

При совместном действии α- и β-амилаз на крахмал 95 % превращается в мальтозу и 5 % - в низкомолекулярные предельные декстрины, содержащие α-1,6-глюкозидные связи.

В просяном и овсяном солодах содержится фермент декстриназа, разрывающий α-1,6-глюкозидную связь в амилопектине и предельных декстринах.

Глюкоамилазе – экзофермент, расщепляющий как α-1,4-, так и α-1,6-глюкозидные связи. Действуя с нередуцируемых концов молекул амилозы и амилопектина, глюкоамилаза отщепляет молекулу глюкозы в β-форме.

Основными факторами, влияющими на скорость ферментативных реакций, являются температура, рН, концентрация веществ в субстрате и ферментов. С повышением температуры ферментативный гидролиз крахмала ускоряется, однако по достижении определенной температуры происходит инактивация ферментов.

β-Амилаза ячменного солода имеет низкую термостойкость при нагревании до 70 °С, она разрушается; тепловая инактивация данного фермента при 70 °С почти полностью завершается за несколько минут.

α-Амилаза ячменного солода обладает более высокой термостойкостью и разрушается при температуре около 80 °С.

Оптимальная температура для β-амилазы в заторе 63 °С, а для α амилазы 70 °С. В оптимальных условиях одна молекула β-амилазы может гидролизовать 237000 связей в минуту.

Оптимальная температура действия глюкоамилазы микроскопических грибов и бактерий 55 – 60 °С. α-Амилаза ферментных препаратов бактериального происхождения обладает высокой термостойкостью. Ее оптимальная температура действия 85 – 95 °С.

Каждый фермент имеет оптимум рН, при котором он наиболее активен; при более высоких или более низких значениях рН активность фермента снижается. Максимальная активность α-амилазы проявляется при рН 5,7, а β-амилазы – при рН около 4,8. при рН 2,3 и 9,7 амилазы полностью инактивируются.

Оптимальная величина рН для α-амилазы микроскопических грибов составляет 4,5 – 5,0, для глюкоамилазы – 4,5 – 4,6, для бактериальной α-амилазы – 5,0 – 6,0.

Скорость ферментативной реакции с увеличением концентрации фермента увеличивается, но до известного предела. До образования 75 – 80 % теоретического количества мальтозы (79,1 – 84,4 г из100 г крахмала) реакция осахаривания протекает быстро, а затем резко замедляется: идет в 1000 раз медленнее, чем в начале расщепления.

С увеличением концентрации экстрактивных веществ в субстрате ферментативный гидролиз крахмала замедляется. Это объясняется тем, что с увеличением концентрации веществ увеличивается вязкость затора, вследствие чего затрудняется процесс диффузии между субстратом и ферментом.

Гидролиз крахмала контролируют обычно по окраске, которую дают промежуточные продукты гидролиза с йодом. Окрашивание происходит в результате расположения молекул йода внутри спиральных витков глюкозных остатков. Цвет образовавшихся соединений обусловлен длиной цепочки глюкозных остатков.

Крахмал с йодом дает синее окрашивание. Близкие к крахмалу самые крупные декстрины – амилодекстрины (молекулярная масса 10000 – 12000) окрашиваются йодом в фиолетово-синий цвет; более мелкие декстрины – эритродекстрины (молекулярная масса 4000 – 7000) – в красно-бурый; самые мелкие – ахродекстрины и мальтодекстрины (молекулярная масса 2900 – 3700) совершенно не окрашиваются.

Сырой неоклейстеризованный крахмал расщепляется под действием амилаз, но очень медленно. Атакуемость амилолитическими ферментами при их действии на клейстеризованный крахмал усиливается. Для ускорения процесса клейстеризации и растворения крахмала зернопродуктов целесообразно подвергать их предварительной тепловой обработке путем запаривания под давлением. При нагревании с водой крахмал переходит из твердого состояния в студнеобразное – он клейстеризуется. При этом происходит набухание крахмальных зерен (гранул) с последующим их разрывом и диспергированием.

С повышением температуры клейстер начинает разжижаться, а затем становится жидким.

Итак, в ходе гидролиза крахмала нужно различать три стадии: клейстеризацию, разжижение и осахаривание.

Требования к ферментативному гидролизу крахмала в бродильных производствах различны. Так, в спиртовом производстве стремятся получить максимально возможное количество сбраживаемых сахаров, так как декстрины непосредственно дрожжами не сбраживаются. В условиях спиртового производства осахаривание декстринов происходит на стадии брожения, когда уже большая часть мальтозы сброжена. Этот процесс имеет большое значение с точки зрения получения наибольшего выхода спирта из крахмала. Поэтому очень важно, чтобы осахаривающие ферменты сохранили свою активность до конца брожения.

В пивоваренном производстве гидролиз крахмала необходимо проводить так, чтобы в сусле кроме мальтозы присутствовало определенное количество ахро- и мальтодекстринов, обусловливающих полноту вкуса и вязкость пива. Для сортов светлого пива гидролиз крахмала ведут до тех пор, пока не образуется 80 – 85 % сбраживаемых сахаров и 15 – 20 % декстринов, не окрашиваемых йодом.